رساله ماجستير في طب بابل عن التوصيف الجزيئي لنظام CRISPR-Cas

جرت في كلية الطب جامعة بابل مناقشة علنية في علم الاحياء المجهرية لطالبة الماجستير شيماء عبد الجبار سعيد الحسيني، حضرها عميد الكلية الاستاذ الدكتور مهند عباس الشلاه ورئيس الفرع الاستاذ الدكتورة هيام خالص المسعودي وعدد من التدريسين وطلبة الدراسات العليا في الفرع، وقد كان عنوان الرسالة (التوصيف الجزيئي لنظام CRISPR-Casوالتنميط المتسلسل متعدد المواقع لعزلات (MLST) Enterococcus faecalisفي محافظة بابل) بإشراف الاستاذ الدكتورة لميس عبد الرزاق عبد اللطيف.
لقد تمّ من خلال هذه الدراسة جمع 105 عيّنة سريرية من مرضى يعانون من عدوى مختلفة كالتهاب المسالك البولية والتهاب المهبل والتهاب الجرح وتجرثُم الدم , والذين تمَّ إدخالهم إلى مستشفيينِ رئيسيينِ في مدينة الحلة , الأولى هي مستشفى الحلة التعليمي الجراحي والثانية هي مستشفى الامام الصادق عليه السلام , للفترة الزمنية الممتدة من ( اغسطس 2022إلى نوفمبر 2202) .
وخضعت جميع أنواع العينات للزراعة الهوائية على أوساط مختلفة , فوجد أنّه من اجمالي ( 105) من العيّنات المزروعة ظهر منها 70 ( 66,6%) هي بكتيرية إيجابية , أمّا الكمية المتبقية من البكتيرية نفسها والتي تبلغ 35 (33,3%) لم يلحظ عليها أي نمو, علماً أنّ جميع العيّنات تمّ زرعها على وسط ( chromogenic agar _ وسط انتقائي ) , وتم تحديد 15 ( 14,2% ) عينة إيجابية على أنّها (E. faecalis)
وبعد ذلك خضعت هذه العزلات لطريقة الكشف الجزئي باستخدام أساس محدد يعتمد على جين D- alanine D-alanine ligase)) كمؤشر جيني للتعرف وبصورة مؤكدة على E. faecalis)) بواسطة ( PCR ) وأظهرت النتائج أنّ ( %15) كانت موجبة ل ( ddl ) .
وتمَّ إجراء العلاقة بين خمس عشرة عزلة E.faecalis باستخدام RAPD-PCR . فأظهر التمهيدي M13 تعدد الأشكال بين اختبار العزلات فولّدَ 14-7) ) نطاقاً يتراوح بين ( 95 - إلى - 3000) زوج قاعدي.
كما وأنّ الرسم التخطيطي للمسافة الجينيّة بين جميع المعزولين بناءً على تعدد الأشكال المتولدة عن ( PCR RAPD- ) بعد استخدام التمهيدي M13)) باستخدام (UPGMA) حيث قسّم المخطط ( cladogram ) جميع العزلات الخمس عشرة إلى مجموعتين , فقد احتوت المجموعة الأولى ( A) على عزلة واحدة فقط ( EF17 ) والمجموعة الثانية ( B) تحتوي على أربع عشرة عزلة , مقسمة ( 14) عزلة إلى مجموعتينِ فرعيّتينِ , المجموعة الفرعية الأولى مقسمة إلى فرعينِ ,
المجموعة الفرعية الاولى احتوت إحداها على عزلتين (EF12-EF13) , بينما احتوت المجموعة الفرعية الثانية على ثلاث عزلات (EF18-EF19-EF20) حيث أنّ المجموعة ( B) أظهرت ارتباطاً وراثياً وثيقاً وبنفس المسافة الوراثية بين بعض العزلات , ممّا أظهر انتشاراً نسيلياً , وأنّ علاقتهم الوراثية الوثيقة القائمة على معامل الاختلاف إلى تباين جيني منخفض بينهما .
ففي هذه الدراسة تمَّ استخدام طريقة التنميط المتسلسل ذات المواقع المتعددة ( MLST ) للتحقيق في القدرة التّميزية , والتكاثر , والعلاقة الوراثية بين خمس عشرة ( 15) عزلة E.faecalis . تعتمد على بيانات التسلسل التي تمّ الحصول عليها من MLST) )لتحديد الهياكل السكّانيّة التي تحلل مدى اختلال التوازن بين الآليات للعلاقة التطورية بين خمس عشرة ( 15 ) عزلة , على جينات التدبير المنزلي الخمسة المستخدمة بشكل متكرر لتحليل (pep C, clpX ,recA ,rpoB,&groEL ) .
وفي الدراسة الحالية تم استخدام MLST لاستكشاف التركيب السكاني وتطور 15 عزلة ( E.faecalis ) من عيّنات سريرية مختلفة والتي قد توفّر معلومات أفضل فيما يتعلق بخصائصها البيولوجية , ولبدأ التحليل تمّ احتساب تنوع التسلسل لجينات التدبير المنزلي الخمسة, فقد تمّ تنفيذ هذه الخطوة لقياس ما إذا كانت هذه المواقع المختارة لديها تميّز كافٍ في الكتابة . ويتراوح عدد الآليات في هذه المواضيع الجينيّة من ( 2 – 7 ) مقارنة بتنوعات تسلسل النيوكليوتيدات متشابهة ولكن منخفضة بشكل عام , مما يعيد تكوين هذه الجينات .
أيضاً تمّ اكتشاف الدراسة الحالية ( ST) في أن تكون فريدة من نوعها في المنطقة , ويمكن أن يساعد المزيد من التحليل وربما التسلسل الجيني لهذه السلالات في تحديد خصائص هذه السلالات .
وفقاً للملف الشخصي الأليلي , وجد أن المتغير الأليلي ( SNP ,الادراج والحذف ) بين العزلات في الحالة كان ( rpoB) أكثر تنوعاً أو تحرراً من جينات التدبير المنزلي الأربعة الأخرى على عكس ( recA) الذي كان أقل تبايناً . ويبدو أن الجين المختار لمخطط ( MLST ) الحالي يمثل تعدد الأشكال العام الذي شوهد في جينات التدبير المنزلي للإشريكية الفاسقة .
تم الاستدلال على نسالة هذه ( ST) , وفي شجرة نسألة (MLST) لجميع سلالات E.faecalis)) إلى الحد الأقصى مثل نهج غطاء المحرك من تسلسل متسلسل . فقد أظهرت جميع عزلات ( E.faecalis ) سلالة متعددة الفصائل وكشفت عن ثلاث مجموعات متميّزة , المجموعة Aتحتوي على عزلة واحدة (EF13 ) والمجموعة ( B ) تحتوي على عزلة واحدة ( EF14 ) والمجموعة C تحتوي على 13 عزلة , تنتشر أنظمة ( CRISPR-Cas ) على نطاق واسع بين التعانق والبكتيريا , والتي تحمي هذه الكائنات الحية من العناصر الوراثية المتنقلة مثل العاثيات والبلازميدات و اللينقولات تتم تضمين آلية عمل هذه الأنظمة في ثلاث خطوات للتكيف والتعبير والتداخل أقترح تحليل الجينوم .
إنّ أنظمة ( CRISPR-Cas ) تتفاعل مع العناصر المتنقلة يحتوي ( E.faecalis ) على نوع واحد من ( CRISPR-Cas ) وهو من النوع الثاني , وهنالك ثلاثة مواضع ل ( CRISPR ) في جينومات ( E.faecalis ) والتي تشمل ( CRISPR1-Cas,CRISPR2-Cas,CRISPR3-Cas).
في هذه الدراسة حددنا حدوث مواضع CRISPR-Cas في بكتيريا ( E.faecalis ) المعزولة من مصادر معدية مختلفة ( البول , المهبل , الجرح ) توزيع وتكرار ثلاثة عناصر مختلفة في عزلات ( E.faecalis) بشكل عام , ثم تحديد CRISPR2 في 8 ( 53.3% ) من العزلات متبوعة ب ( CRISPR1-Cas,CRISPR3-Cas ) (33.3%,20%)على التوالي , وأظهرت الدراسة الحالية إنّ وجود مواضع CRISPR كان متغيّراً بين عزلات E.faecalis كانت العزلات أكثر عرضة لإيواء CRISPR2 اليتيم من CRISPR1-Cas,CRISPR3-Cas
بقلم: عباس مجيد